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1、選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，在凍存前一天*換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% yi 蛋白酶消化。適時去掉yi蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。

2、去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

3、將上述細(xì)胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細(xì)胞種類及代次、凍存支數(shù)）。

4、將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，蕞后沉入液氮中。

細(xì)胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，*取出一只安瓿細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。